54
PROGRAMME AND ABSTRACT BOOK
ABS TRAC T BOOK
11) Zvýšená expresia miR-21 a miR-221
v preeklamptických placentách tehotenských
patológií
Vážan M.
1,3
, Švecová I.
2
, Lasabová Z.
1
1
Ústav molekulovej biológie
2
Gynekologicko-pôrodnícka klinika
3
Ústav patologickej anatómie, Jesseniova lekárska fakulta
v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave
Preeklampsia je a multisystémové ochorenie s čiastočnou
genetickou a imunologickou etiológiou; pri apoptóze sa pred-
pokladá, že zohráva úlohu v rozvoji preeklampsí. MikroRNA
sú malé nekódujúce molekuly, ktoré sa podieľajú na regulácii
bunkových procesov, vrátane apoptózy. Z tohto dôvodu sme
nadizajnovali 96-jamkovú reakčnú platničku pre analýzu 21
mikroRNA nanesených v duplikách, o ktorých je známe, že
sa podieľajú na regulácii apoptózy a sú vysoko exprimované
v placentárnom tkanive. Pre samotný experiment sme vybrali
nasledovné druhy mikro RNA. Pro-apoptotické mikroRNA: mir-1,
let-7c, let-7g, mir-200c, mir-143, mir-205, mir-122, mir-409-3p,
mir-449, mir-708, mir-149, mir-204, mir-133. Anti-apoptotické
mikroRNA: mir-214, mir-221, mir-222, a mikroRNA s pro-aj anti-
-apoptotickou aktivitou mir-29a a mir-29c. Normalizáciu metódy
sme uskutočnili voči RNU44 (endogénna kontrola). Vybrané
druhy mikroRNA boli vyextrahované z placentárnych tkanív,
získaných z preeklamptických a zdravých (kontrolných) pacien-
tiek. Po špecifickej tzv. „stem-loop primer“ reverznej transkripcii,
uskutočnenej v mikroskúmavkách, sme úspešne prepísané
vzorky analyzovali na spomínaných reakčných platničkách a vy-
hodnotili pomocou Pfafflovho matematického modelu pre re-
latívnu kvantifikáciu pomocou RT PCR v podobe delta delta Ct
algoritmu. Neprirodzená nadexpresia vybraných druhov miRNA
bola overená pomocou TaqMan MikroRNA testu relatívnej
kvantifikácie so štandardnými krivkami. Analýzy vybraných 21
mikroRNA odhalili zvýšenú expresiu pri týchto miRNA: mir-122,
mir-21, mir-221, mir-29a, mir-29c a mir-449. Samotná validácia
bola uskutočnená na 13-tich preeklamptických placentárnych
vzorkách odobraných po pôrode a na 6-tich placentárnych
vzorkách vrátane jednej referenčnej vzorky, získaných od pa-
cientiek po normálnom fyziologickom pôrode. Zistili sme
signifikantne zvýšenú expresiu mir-21 a mir-221 s p = 0,0055
(CI95 % s intervalom spoľahlivosti 25,2–123,47) a p = 0,0047
(CI95 % s intervalom spoľahlivosti 12,16–57,20). Aj keď je validá-
cia na väčšom počte vzoriek určite potrebná, analýza miRNA
deregulácie môže v neposlednom rade pomôcť pri identifikácii
deregulovanej signalizácie v preeklamptických placentách pre
detekciu nových biomarkerov.
12) Imunohistochemická analýza FOXP3+
T regulačních lymfocytů u kožních
melanocytárních lézí
Židlík V.
1
, Brychtová S.
3
, Dvořáčková J.
1,2
,
Uvírová M.
1
, Hurník P.
1
, Šustíková J.
1
1
CGB laboratoř a.s.
2
FNO Ostrava
3
Ústav klinické a molekulární patologie, LF UP Olomouc
Transkripční faktor FOXP3 je proteinem exprimovaným
regulačními T lymfocyty (Treg) a je znám jako klíčový prvek
jejich funkce při udržení imunologické homeostázy. Přítomnost
Treg je v organizmu nutná k navození imunologické tolerance
a prevenci autoimunitních onemocnění. Aktivace Treg se pro-
jevuje zejména inhibicí cytotoxických CD8+T lymfocytů a NK
buněk. V poslední době se pozornost věnuje roli Treg v pro-
gresi nádorových onemocnění. U řady maligních nádorů, jako
jsou karcinomy GIT, ovária a mammy bylo prokázáno, že Treg
významně snižují protinádorovou imunitní obranu a navozují
toleranci proti nádorových antigenům. Výsledky některých
studií uváději, že terapeutická inhibice Treg oslabila jejich imu-
nosupresivní působení a vedla k aktivaci nádorově specifických
efektorových T lymfocytů a zlepšení průběhu onemocnění.
U maligního melanomu jsou FOXP3+Treg považovány za jeden
z markerů časného metastazování a horší prognózy.
Materiál a metody:
Vyšetřili jsme soubor 82 kožních
maligních melanomů a 25 benigních pigmentových névů.
Melanomy byly rozděleny dle WHO klasifikace podle hloubky
vertikální invaze koria do čtyř skupin – pT1 (n = 35 melanomů),
pT2 (n = 17 melanomů), pT3 (n = 18 melanomů) a pT4 (n = 12
melanomů). Byly použity tkáně fixované ve formalínu a zali-
té do parafínu. Detekce byla provedena metodou nepřímé
imunohistochemie v barvícím automatu VENTANA, s primár-
ní monoklonální králičí protilátkou FOXP3 Antibody (Novus
Biologicals, clone SP97, NBP2-12498, ředění 1:150). Hustotu za-
stoupení jednotlivých Treg jsme hodnotili pomocí světelného
mikroskopu počítáním FOXP3 pozitivních Treg na 1 mm
2
v tzv.
„hot spot“, tj. v místě největší hustoty buněk. FOXP3+Treg jsme
hodnotili jednak přímo v nádoru, a dále na jeho periferii, v místě
nejhlubší invaze. Počty Treg jsme dále porovnávali s počty CD3
T lymfocytů a i zde jsme hodnotili zvlášť oblasti uvnitř nádorou
a na jeho periferii.
Výsledky:
V naší imunohistochemické analýze jsme proká-
zali rozdíly v hustotě zastoupení Treg mezi jednak melanomy
a benigními pigmentovými névy, tak i mezi jednotlivými skupi-
nami melanomů. U skupiny pT1 byl medián Treg v melanomu
22, na periferii 6, medián pro skupinu pT2 byl v ložisku 55, na
periferii 15, pro skupinu pT3 v melanomu 58, na periferii 16 a pro
skupinu pT4 v ložisku melanomu 23 a na periferii 3,5. Ve sku-
pině névů se FOXP3+Treg vyskytovaly ojediněle, s mediánem
5 uvnitř léze, na periferii Treg zaznamenány nebyly. Při srovnání
poměru CD3/FOXP3+Treg byl ve skupině pokročilejších mela-
nomů T2 a T3 na periferii léze patrný posun ve prospěch Treg.
Naopak u melanomů pT4 docházelo ke snižování FOXP3+Treg
